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淺談化學(xué)發(fā)光免疫分析的研究進展論文
建立在放射免疫分析技術(shù)理論基礎(chǔ)上的化學(xué)發(fā)光免疫分析，是一種非放射標(biāo)記免疫分析法，這種免疫分析方法主要以標(biāo)記發(fā)光劑為示蹤物信號建立起來。近十年來在世界范圍內(nèi)發(fā)展迅速，它具有高靈敏度、檢測范圍寬、操作簡便快速、標(biāo)記物穩(wěn)定性好、無污染、儀器簡單經(jīng)濟等優(yōu)點。
1 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的研究歷史背景
免疫分析的發(fā)展伴隨著抗體制備技術(shù)的改進而不斷提高。美國科學(xué)家Yalow等人首先將標(biāo)記技術(shù)引入免疫分析，他們首先用放射免疫分析法(RIA)進行測定胰島素。由于這種試驗方法限制了試劑的壽命，難以獲得長期穩(wěn)定的檢測標(biāo)準(zhǔn)，同時由于存在同位素的使用，不僅會損害操作人員身體健康，也會帶來污物處理困難的問題。為了找到更為合理的免疫分析法成為以后20年來研究的熱點。直到70年代末，國外有學(xué)者將免疫反應(yīng)與化學(xué)發(fā)光測定技術(shù)相結(jié)合，這種集高靈敏度和高特異性的技術(shù)稱之為化學(xué)發(fā)光免疫分析法，化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)優(yōu)勢比較明顯，主要有以下幾點：第一，靈敏度高，檢測限范圍更精準(zhǔn);第二，自動化程度高，并且沒有放射性輻射危害;第三，發(fā)光標(biāo)記物穩(wěn)定，有效期長，同時應(yīng)用范圍寬，對于分子大小不同的抗原、半抗原及抗體都可檢測。因此，化學(xué)發(fā)光免疫分析在臨床、衛(wèi)生、食品、環(huán)保和軍事等領(lǐng)域正被越來越多地用于激素、蛋白質(zhì)、腫瘤、毒物、病毒等成分檢測。
2 免疫分析基本原理
由免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)兩個關(guān)鍵部分組成了化學(xué)發(fā)光免疫分析的基本原理，化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)主要氧化以及催化的作用于化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，產(chǎn)生一個激發(fā)態(tài)的中間體，在處于穩(wěn)定狀態(tài)時，發(fā)射出光子，然后通過測量儀器測量光量子。通過標(biāo)記物與發(fā)光強度的關(guān)系，進而測出被測物質(zhì)含量。而免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將發(fā)光物質(zhì)在抗原或抗體上直接標(biāo)記。
3 化學(xué)免疫分析分類
化學(xué)發(fā)光免疫分析法主要以標(biāo)記法的不同來進行分類，目前習(xí)慣上將免疫分析法主要分為兩類，第一主要是標(biāo)記免疫分析法，其次是酶免疫分析法，前者是以化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，后者是以酶標(biāo)記，以化學(xué)發(fā)光底物作為信號試劑來進行發(fā)光，其原理是不相同的。除此之外，包括熒光免疫分析法以及電化學(xué)發(fā)光免疫分析法也是目前存在的化學(xué)免疫法分析方法。
3.1 化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析
將化學(xué)發(fā)光劑如吖啶酯類化合物，直接標(biāo)記在抗原上或抗體上，其基本原理是啟動發(fā)光劑發(fā)光，快速閃爍。這種標(biāo)記物其化學(xué)反應(yīng)簡單、快速、無須催化劑;夾心法用于大分子抗原，競爭法主要用于檢測小分子抗原，另外本底低，非特異性結(jié)合相對較少光量不會因為分子大小而受影響，因此能增加靈敏度，一般常用的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)主要是通過啟動發(fā)光試劑NaOH-H2O2作用而發(fā)光，其發(fā)光非常迅速，小分子物質(zhì)多采用競爭法，夾心法主要用于大分子物質(zhì)。
3.2 化學(xué)發(fā)光酶免疫分析
通過酶標(biāo)記生物活性物質(zhì)，再作用于發(fā)光底物，在信號劑的作用下發(fā)光，然后用發(fā)光測定儀進行測定�；瘜W(xué)發(fā)光酶免疫分析酶反應(yīng)的底物是發(fā)光劑，按照標(biāo)記免疫分析，應(yīng)屬酶免疫分析，其操作步驟與酶免分析完全相同。目前常用的標(biāo)記酶為堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶，它們有各自的發(fā)光底物。化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法種類大致有三種，首先是HRP標(biāo)記CLEIA，一般常用3-氨基鄰苯二甲酰肼作為底物，也即是魯米諾或者用其衍生物4-氨基鄰苯二甲酰肼也是可以的，這兩種都是重要的發(fā)光試劑。需要注意的是該底物需要在堿性緩沖溶液中進行氧化反應(yīng)，生成激發(fā)態(tài)中間體，當(dāng)然這需要在過氧化物酶及活性氧存在的條件下進行，中間體回到基態(tài)時就可以發(fā)光，此時的波長一般在425nm。曾經(jīng)先前有人用該標(biāo)記底物標(biāo)記抗原或抗體，但后來發(fā)現(xiàn)其發(fā)光強度多受靈敏度的影響。目前用過氧化物酶進行標(biāo)記，其發(fā)光強度主要依賴酶免疫反應(yīng)中的酶的濃度大小;其次增強發(fā)光酶免疫分析也是化學(xué)發(fā)光酶免疫分析的一種，它主要是在將增強的發(fā)光劑加入到發(fā)光系統(tǒng)中，加強發(fā)光的信號強度，并且能夠保持長時間的穩(wěn)定性，在一定程度上提高了該分析方法的準(zhǔn)確性和靈敏度，便于多次測定。目前在一些現(xiàn)代化的設(shè)備上，還可以由計算機進行精確控制操作，比如，往系統(tǒng)中加入發(fā)光試劑以及混合、溫育、洗滌等，甚至后期的數(shù)據(jù)處理，進而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終完成患者血清樣品的分析并打印出結(jié)果;最后一種就是用ALP標(biāo)記的CLEIA，這種分析方法一般多用環(huán)-1，22-二氧乙烷衍生物作為發(fā)光底物，它的發(fā)光原理主要是其用化學(xué)發(fā)光酶免疫分析底物而設(shè)計的分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)固，其中的芳香基作為發(fā)光基團和酶作用，在發(fā)光試劑的作用下發(fā)光，該底物在堿性磷酸酶的作用下，磷酸酯基發(fā)生水解而脫去一個磷酸基，就會產(chǎn)生一個穩(wěn)定的中間體，然后中間體發(fā)生裂解會產(chǎn)生金剛烷酮和激發(fā)態(tài)的物質(zhì)，這種常見底物是AMPPD，其作為磷酸酯酶的直接化學(xué)發(fā)光底物，多用來檢測堿性磷酸酯酶和一些配基的結(jié)合物。
4 應(yīng)用
4.1 激素、蛋白質(zhì)和腫瘤檢測
該系統(tǒng)使反應(yīng)物形成均相混懸液，順磁微粒作為固定相，增大反應(yīng)面積，加速免疫反應(yīng)，快速分離，自動洗滌，減少酶和催化劑的使用，pH調(diào)整即可，避免了許多影響因素，廣泛應(yīng)用于甲狀腺功能、藥物檢測、腫瘤標(biāo)志物及心血管等項目。
4.2 病毒、毒物檢測
楊秀岑等用ABEI標(biāo)記兔抗大腸桿菌lgG，試樣溫育、離心、沉淀峰值用luminol-H2O2-NaOH 發(fā)光體系測定;章竹君等測定了糞樣中的輪狀病毒以HRP酶標(biāo)記;為研究TNT對人體的毒害作用提供方法，張麗民等以HRP標(biāo)記免疫測定了血清中4-氨基-2，6-二硝基甲苯，效果非常顯著。
4.3 其他方面的應(yīng)用
被越來越多地用于免疫測定中的HRP酶標(biāo)記生成核酸探針，主要采用兩種形式，一種是靶DNA雜交，將HRP直接標(biāo)記在探針上，同時增強的魯米諾試劑檢測加入分離后的雜交體。另外一種是將DNA探針標(biāo)記在生物素及地高辛上，然后與靶DNA雜交，再用HRP標(biāo)記的親和素和抗地高辛與分離后的雜交體結(jié)合，最后加入魯米諾試劑氧化發(fā)光。
5 展望
化學(xué)發(fā)光免疫分析已成為生物技術(shù)領(lǐng)域的一種重要的檢測方法，其相比較于傳統(tǒng)的放射免疫分析方法，其安全、穩(wěn)定、測量快速等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用。當(dāng)然，目前化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)也存在不少的問題，例如，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物質(zhì)量和穩(wěn)定性差，包括標(biāo)記技術(shù)都是比較落后的。因此，要想獲得更為廣泛的發(fā)展和使用空間，首先要加快國產(chǎn)發(fā)光免疫分析試劑盒的研發(fā)，另外要提高分析和測定的穩(wěn)定性，只有這樣，將來化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)用于臨床醫(yī)學(xué)檢驗，才能帶來更大的獲益。
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