- 相關推薦
小研殼聚糖-明膠三維支架的研究?氣道平滑肌細胞培養
1 前言
在組織工程中，三維多孔支架為種植的細胞提供生物力學的支持，使細胞形成功能性的組織[1,2]。報告顯示，除了基底的化學性質，支架的結構體系對組織的培養起著重要作用。
近年來，多孔支架的構建和發展在組織工程中的多種應用受到了廣泛的關注[3-6]。
膠原是動物體內含量最豐富的蛋白質，屬于不溶性纖維蛋白質，遍布于體內各種器官和組織，如皮膚、骨、軟骨、肌腱、角膜等等。明膠（Gelatin. Gel），是膠原的部分變性衍生物，無抗原性，生物相容性好，可生物降解[7]。
甲殼素是一種天然高分子化合物，屬于多糖。殼聚糖（Chitosan, CS）, 是甲殼素的脫乙酰化產物，是細胞外基質中糖胺聚糖結構類似物。殼聚糖是一種具有優良生物相容性的可降解材料，其在哺乳動物體內能被溶菌酶降解成氨基糖，氨基糖可以進入糖胺聚糖和糖蛋白的代謝循環，也可以排除體外。它還具有低抗原性、促進傷口愈合，抗菌等特性。此外殼聚糖是帶正電荷的線性多糖，它可與帶負電的生物大分子，如明膠形成聚電解質配合物。殼聚糖還具有較好的力學性能，而且易于加工成型。綜合明膠和殼聚糖的優點，將殼聚糖和明膠復合制備多孔支架材料, 將能滿足對支架材料的要求[8-10]。
目前，氣管組織工程研究的方法是在體外的支架材料上培養氣道平滑肌細胞(airwaysmooth muscle cell, ASMC )，形成有功能的組織。本實驗研究在不同條件下制備殼聚糖-明膠三維支架的結構和性質，以及平滑肌細胞在支架中生長的狀態，為篩選可作為氣道組織工程研究用的材料奠定基礎。
2 材料和方法明
明 膠（ Sigma Chemical Co. ） ； 殼聚糖（HaiHui Bioengineering Co. ） ； 溶菌酶（7000u/mg,Biosharp,Japan）；戊二醛(分析純,成都科龍化工試劑)；醋酸（分析純，成都科龍化工試劑）；DMEM/F-12 培養基（Hyclone, USA）；胎牛血清(Sigma, USA)；培養用三蒸水；細胞培養瓶及培養板（Costar，USA）；MTT（Sigma, USA）；FITC-Phalloidin（Sigma,USA）。
2.1 制備三維殼聚糖-明膠支架
實驗選用的殼聚糖為精制殼聚糖。稱取一定量的殼聚糖用1wt%的醋酸，在室溫下溶解，然后在加入明膠（殼聚糖、明膠質量按1：1 比例），使明膠、殼聚糖充分混合溶解，配制成濃度為1、2、3wt%的混合溶液。將混合溶液分裝到培養板，然后分別放入不同溫度（-20℃，-80℃，-196℃）下預凍。預凍24 小時后，放入冷凍干燥機凍干24 小時。然后對材料進行（用0.25%戊二醛）交聯處理，用硼氫化鈉脫醛，用蒸餾水洗凈后，二次凍干，將材料放入干燥器備用。
2.2 結構觀察
用掃描電子顯微鏡（SEM，TESCAN VEGA ?? LMU）對支架的架構進行觀察。在使用SEM 觀察支架之前，先用液氮冷凍支架的表面和部分使之斷裂,然后噴涂上金。支架孔的平均直徑作為支架的有效孔徑。隨機選擇每個樣品的三個不同區域，至少選擇20 個孔測量孔徑。
2.3 孔隙度的測量
我們采用液體轉化法來測量三維支架的孔隙度[11,12]。殼聚糖、明膠均不溶于正己烷，因此選用正己烷為轉換劑。正己烷能滲透進入相互關聯的支架孔中，所產生的膨脹和皺褶可以忽略不計。測量時，首先將支架浸入裝有正己烷的量筒中5 分鐘，原正己烷的體積記為（V1）。
支架浸入量筒后，原正己烷和支架的總體積記為（V2）。取出支架后，剩余的正己烷體積記為（V3）。支架的孔隙度ε 可以通過以下公式獲得：ε（%）=（V1－V3）／(V2－V3) [13]。
2.4 大鼠氣道平滑肌細胞的培養
本實驗采用組織貼塊法來制備大鼠氣道平滑肌原代細胞[14]。然后對原代細胞進行傳代，使用第3 代的平滑肌細胞。所用培養基為DMEM/F-12 和10%胎牛血清。將細胞培養在37℃，5%CO2 的條件下，每三天換一次液。當細胞爬滿培養瓶的80-90%時，可用于實驗。
2.5 細胞在殼聚糖-明膠三維支架中的增殖
將原代培養大鼠氣道平滑肌細胞的第3 代，稀釋到細胞濃度為2×104 個/ml。在裝有三維支架的24 孔板中，每孔加入含有氣道平滑肌細胞的培養基500μl。培養到1、3、6d 分別用MTT 法檢驗細胞的活性。每孔加入100μlMTT（5mg/ml），在37℃，5%CO2 的培養箱中培養4h。吸去孔內上清液，每孔加入500μl 二甲基亞砜（DMSO）溶解轉化的染料。再從每孔取出100μl 溶液轉移到96 孔板，用酶標儀測定490nm 處溶液的OD 值[15]。
2.6 免疫熒光染色
將細胞種植于三維支架材料上以后，選擇適當的時間，對細胞骨架進行染色。實驗步驟：
吸棄培養板中的培養液；用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細胞2 次，每次10 分鐘；4%的多聚甲醛固定20 分鐘，用PBS 清洗細胞2 次；0.1%Triton X-100/PBS 室溫破膜5 分鐘，PBS 清洗細胞3 次；加入5ug/ml 的FITC-Phalloidin 室溫染色40 分鐘，避光過夜；用PBS 清洗細胞2 次；吸去多余水分，加熒光封片液（中性或偏堿性緩沖液加等量甘油）封片，用熒光顯微鏡(萊卡,CTR,6000)觀察[16,17]。
2.7 統計學方法
所有實驗都反復進行4 次，數據用平均值±標準方差表示，n=4。組間數據采用χ2 分析，p<0.01 表示差異有顯著統計學意義；p<0.05 表示差異有統計學意義。計算、統計軟件采用Originpro7.5 及ImageJ 1.4g program。
3 結果
3.1 預凍溫度和材料濃度對支架微結構的影響
本研究制備的殼聚糖-明膠支架采用冷凍干燥法，冷凍干燥是先將物料凍結，然后在接近真空條件下升華逸出溶劑分子的一種干燥方法。該方法既能維持混合物在凍前的外形，又使其具有多孔海綿狀結構。冷凍過程中在聚合物網絡中形成冰晶模版，在低于冰點的溫度下冷凍干燥，冰升華后形成多孔結構。本研究以水作為致孔劑，通過控制冷凍溫度可調節冰晶大小，從而控制孔徑大小[18]。把殼聚糖-明膠混合材料以不同的濃度和預凍溫度制得支架。圖1 顯示出混合物在預凍溫度分別為-20℃、-80℃、-196℃，濃度為1 wt%，2 wt%，3wt%時，形成支架的形態。通過觀察，發現當預凍溫度為-20℃，混合物濃度為1wt%時，孔徑的最大范圍是在60-100μm。在相同的預凍溫度下，混合物的濃度為2wt%和3wt%，孔徑較小，分別為40-80μm 和35-50μm。類似的，我們可以觀察到預凍溫度越低，所得到的孔徑越小(表1)。在不同的預凍溫度下，隨著支架孔徑的大小變化，支架的孔隙度也在發生變化。當支架的預凍溫度在-196℃時，其孔隙度高于預凍溫度在-20℃和-80℃的支架。
比較不同的預凍溫度，最高的孔隙度為93±0.6 %，其預凍溫度為-196℃。而同樣的預凍溫度下，濃度為2wt%和3wt%的支架的孔隙度降為90±0.6%和84±4.7%（表1）。在-20℃、-80℃的預凍溫度下，孔隙度有著同樣的變化趨勢，而相比于-196℃的預凍溫度，孔隙度都降低了，顯示出孔隙度取決于材料的預凍溫度和濃度。
凍干過程是在冰點以下使材料中冰晶升華，形成與原冰晶同樣尺度的孔徑。在較低的預凍溫度下，由于冷凍速度較快，形成數量較多和體積細小的冰晶，導致凍干材料孔徑較小，孔壁較薄，孔隙度較大。在預凍溫度較高時，冰晶可以不斷生長，形成數量較少和體積較大的晶體，導致凍干材料孔徑較大，孔壁較厚，孔隙度較小 [19]。而溶液的濃度直接影響溶液的粘度。當溶液濃度較大即粘度較大時，不利于水和分子鏈的遷移，以至于形成的冰晶較小。
因此孔徑與溶液的濃度成反比[13]。
3.2 細胞在支架中的生長
通過掃描電鏡來觀察平滑肌細胞在材料上的生長。由圖2 可以看出，細胞接種到三維支架上以后，能貼附到支架上，在細胞數較少的情況下，細胞更趨向于沿著孔壁生長。多孔結構的優勢在于為細胞提供了足夠的生長空間和更大的附著面積, 同時有利于營養成分的進入和代謝產物的排出而不致引起細胞的生長抑制作用[20]。培養6 天的時間內，細胞在支架上黏附生長良好，但細胞并未完全伸展。同時細胞沒有鋪滿孔壁，還較少向孔中生長。
3.3 MTT 檢測細胞增殖
通過MTT 實驗來測試氣道平滑肌細胞在材料中的細胞活性。細胞在材料中的生長受到多種因素的影響，包括表面結構、理化性質等。把等量的細胞種植于支架中。由圖3 可見，隨著時間的增加OD 值也隨之增加，說明細胞在材料中生長良好。同時有圖3 可以看出，支架的微結構對細胞的增殖情況有一定的影響。實驗發現，隨著支架孔徑以及孔隙度的增大，時間的延長， 細胞的增殖情況良好。而且孔隙度對細胞增殖的影響較為顯著（*p<0.01,**p<0.05）, 說明支架的孔徑對細胞的增殖起著重要的作用，然而支架的孔隙度在細胞增殖過程中起著更為顯著和決定性作用。
3.4 免疫熒光染色
FITC-Phalloidin 可特異的與真核細胞的filamentous actins 結合，從而顯示微絲骨架在細胞中的分布。通過FITC-Phalloidin 標記細胞的filamentous actins 來觀察細胞的生長形態。FITC-Phalloidin 標記細胞的filamentous actins 在熒光顯微鏡下呈綠色。由圖4，可以觀察到細胞在材料生長狀態良好，細胞呈現出各種形態，有放射狀，圓形，條形等。細胞骨架結構清晰。
4 討論
眾所周知，細胞在三維支架中的存活和增殖受到支架的孔徑和孔隙度的影響。許多研究表明要在一定范圍增強細胞在支架中的存活、增殖，要么增加支架的孔徑，要么增加支架的孔隙度，或者同時增加孔徑和孔隙度的大小[21,22]。在本研究中，我們認為孔隙度對細胞存活和增殖的影響不同于孔徑，孔隙度的改變對細胞在支架中的存活和增殖影響更為明顯。采用冷凍干燥法可以成功制備殼聚糖-明膠三維支架，支架的孔隙結構取決于預凍過程中形成冰晶的數量和大小。在構建三維支架時，我們可以通過改變預凍溫度和濃度，來調節支架的孔隙度與孔徑，從而改變支架的微結構。由此，可以根據需要，來構建合適的殼聚糖-明膠三維支架。同時，發現大鼠氣道平滑肌細胞在殼聚糖-明膠三維支架中生長時，支架的相對孔徑、孔隙度越大，細胞生長越好。
在組織工程的進程中，發展一種適合細胞生長的材料是很重要的。材料的結構和性質對形成有功能性的組織起著重要的作用。大鼠氣道平滑肌細胞在殼聚糖-明膠支架中的良好生長情況，顯示出支架的生物相容性和適合細胞生長的特性，殼聚糖-明膠支架顯示出了在組織工程領域良好的應用前景。
【小研殼聚糖-明膠三維支架的研究?氣道平滑肌細胞培養】相關文章：
小研三維虛擬場景漫游系統的設計與實現03-03
川芎嗪洗脫支架預防支架內再狹窄的實驗研究03-08
明膠酶A及其與腫瘤侵襲轉移的相關研究進展03-08
呼吸道三維模型的建立及其應用03-02
支架式音樂教學模式及其實證研究論文11-17
黃芪對哮喘患者氣道反應性的影響11-22
從對立、三維角度闡發老子對道的理解理念12-04
氣道檢查是否能夠預見插管困難03-08