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淺析蠟狀芽孢桿菌生物強化反硝化脫氮論文
生物強化技術是向傳統的生物處理系統中引入具有特定功能的微生物，提高有效微生物的濃度，增強對難降解污染物的降解能力，提高其降解速率，并改善原有生物處理體系對目標污染物的去除效能。目前，生物強化技術應用最為普遍的方式是直接投加對目標污染物具有特效降解能力的微生物，當原處理系統中不含高效菌種時，如果投入一定量的高效菌種，則可有針對性地去除廢水中的目標污染物； 當原處理系統中只存在少量高效菌種時，投加高效菌種后，可大大縮短微生物的馴化時間，加快系統的啟動，增強系統的耐負荷沖擊能力和穩定性。筆者從啟動成功并穩定運行的反硝化反應器中富集分離出1 株高效反硝化功能菌，在鑒定該菌株后進行擴大培養，采用直接投加功能菌法進行生物強化研究，對比考察了普通工藝與生物強化工藝從啟動到穩定運行的反硝化脫氮效果。
1 試驗材料與方法
1。 1 試驗裝置
試驗裝置。采用序批式反應器（ 有效容積為15 L） ，考察硝酸鹽為電子受體的反硝化脫氮運行效果。瞬時進水，通過攪拌器使泥水混合均勻，在運行期間保持反應器較好的厭氧/缺氧狀態。試驗用活性污泥取自某污水處理廠的沉淀池，該污泥具有初步的脫氮能力，活性污泥不進行培養馴化直接投入反應器，以厭氧/缺氧方式啟動運行，反應器每天運行3 個周期，每個周期運行8 h，其中厭氧180 min、缺氧260 min、排泥排水40 min。r每周期開始瞬時加入含碳有機合成物5 L，缺氧期開始用恒流泵加入硝酸鈉溶液5 L，硝態氮濃度從啟動時的40 mg /L 逐漸增大直到穩定運行。系統MLSS 約為3 000 mg /L，HRT 為16 h，SRT 為30 d，pH 值控制在7。 0 ～ 8。 0。原則上當NO —3 — N 去除率> 90% 時，進水NO —3 — N 負荷正常以20 mg /L 遞增，同時兼顧出水水質的穩定性。反應器運行過程中，分析檢測運行參數，以便判斷反應器運行狀況并對其參數作相應調整。試驗對比普通生物脫氮工藝和生物強化脫氮工藝的運行狀況，每周期監測進出水NO —3 — N、NO —2 — N 濃度，每天從3 組數據中選擇效果最好的一組作為當日的代表數據。
1。 2 試驗水質
進水采用人工合成污水，水質成分如下： 葡萄糖（ COD） ，NaNO3（ NO —3 — N） ，KH2PO4為6 mg /L，CaCl2為10 mg /L，MgSO4·7H2O 為90 mg /L，NH4Cl（ NH +4 — N） 為20 mg /L，微量元素溶液為2 mL /L。微量元素成分如下： CuSO4·5H2O 為30 mg /L，KI為180 mg /L，MnCl2·4H2O 為60 mg /L，NaMoO4·2H2O 為60 mg /L，ZnSO4·7H2O 為120 mg /L，CoCl2·6H2O 為150 mg /L，EDTA 為10 g /L。其中COD、NO —3 — N 濃度隨工藝運行逐步遞增，基本原則為COD ∶ NO —3 — N = 4 ∶ 1，NaNO3（ NO —3 — N） 在缺氧期加入。厭氧期進水pH 值為7。 8 ± 0。 2，缺氧期進水pH 值為7。 2 ± 0。 2，以NaHCO3或HCl 調節pH 值。普通裝置和生物強化裝置，除進水NO —3 — N、COD 濃度不同外，其余運行條件全部相同。
1。 3 分析項目與方法
COD： COD 快速測定儀； 硝酸鹽： 紫外分光光度法； 亞硝酸鹽： N — （ 1 — 萘基） — 乙二胺分光光度法；pH 值： 玻璃電極法。
1。 4 生物強化菌種來源
生物強化反硝化試驗菌種分離自前期穩定運行的反硝化脫氮污泥。優選得到的高效功能菌斜面保存備用。
1。 4。 1 菌種分離培養基
2。 0 g 的KNO3，5。 0 g 的葡萄糖，1 g 的K2HPO4，1g 的KH2PO4，0。 2 g 的MgSO4·7H2O，15～ 20 g 的瓊脂，1000 mL 的蒸餾水，pH 值為7。 2 ～7。 5， 121 ℃條件下滅菌20 min。
1。 4。 2 菌種優選
將初選出的菌株擴大培養后，無菌高速冷凍離心分離，等量接種到裝有200 mL 試驗用水的靜態試驗裝置進行搖床培養，定時取樣，測定NO —3 — N、NO —2 — N 濃度變化，比較其反硝化能力。由于所篩菌株為后續生物強化輔助技術提供菌源，所以靜態試驗水質結合反應器實際運行情況，進一步提高硝酸鹽濃度，以篩選出脫氮能力強的功能菌。水質如下： 葡萄糖（ COD） 為1 000 mg /L，NaNO3（ NO —3 — N） 為400 mg /L，其余成分同1。 2 節。
1。 4。 3 菌株鑒定
對優選出的代表菌株進行其單一菌種的相關特性研究[5]，在進行形態觀察及生理生化試驗的基礎上，進行16S rDNA 的序列測定，從分子生物學的角度進一步鑒定其屬種。
1。 5 生物強化研究
本試驗為生物強化技術進行反硝化脫氮是否可行的初步探討，所以采用操作較為簡單的活化菌液直接投加。每次提高進水NO —3 — N 負荷時投加生物強化優勢菌，投加時先將斜面保存的純種優選菌株活化后進行擴大培養，再將獲得的擴大培養菌液無菌高速冷凍離心分離，最后用無菌水將離心物洗出變成純菌液。菌的含量為108 ～ 109 CFU/mL，每次按處理水量體積的2%投加。
2 結果與討論
2。 1 功能菌篩選結果
通過篩選，有7 株菌對目標物具有良好的去除效果，該7 株菌分別暫命名為F5Y、FC、FZ、FC1、FRB、FH、FH2。，在電子受體NO —3 — N 濃度為400mg /L 的條件下，培養1 d 后，各菌株對NO —3 — N 的去除能力有很大差異，效果最突出的是FC1 和FH2，對硝酸鹽的去除率分別為87。 5% 和80%，同時，這兩株菌對亞硝酸鹽的積累也很少，硝酸鹽很快被代謝掉。第3 天硝酸鹽就未被檢出，亞硝酸鹽含量也很低，第4 天亞硝酸鹽全部被代謝。菌株FC最終對硝酸鹽的去除效果也很好，期間亞硝酸鹽的積累現象不明顯，但反應周期較前兩株菌的要長。通過對比，菌株FC1、FH2 可以將初始濃度為400mg /L 的NO —3 — N 幾乎全部還原，從亞硝酸鹽的還原情況可知，它們對NO —3 — N 的去除建立在將其轉化為氣態產物之上，應該具有完整的反硝化酶系，從而表現出了較強的脫氮能力。綜合考慮NO —3 — N的去除率、去除速率以及NO —2 — N 的積累情況，選取菌株FH2 進行后續的研究，該菌株對400 mg /L的NO —3 — N 的去除率可達100%，且處理時間短，反應過程中基本無NO —2 — N 的積累，作為生物強化處理高濃度氨氮廢水的菌源，應具有較好的應用性。
2。 2 生物強化菌株的鑒定結果
2。 2。 1 菌株FH2 的形態觀察及生理生化試驗結果
對優選菌株FH2 進行形態觀察，結果顯示，菌體形態： 桿狀； 菌落形狀： 不規則； 隆起形狀： 扁平； 邊緣形狀： 毛玻璃狀； 顏色： 淡黃； 透明程度： 不透明； 粘稠度： 不粘。對其進行生理生化試驗，結果表明，革蘭氏染色、芽孢染色、異染顆粒染色、鞭毛染色、硝酸鹽還原、葡萄糖發酵試驗、觸媒試驗、V。 P 試驗均呈陽性，莢膜染色呈陰性，兼性厭氧。
2。 2。 2 16S rDNA 的序列測定和分析結果
為了進一步確定菌株FH2 的屬性，對其進行了16S rDNA 序列測定。將測得的序列用Sequcecher軟件進行拼接，去掉載體序列以及重復序列，得到16S rDNA 全序列。全序列以BLAST 軟件在Gen—Bank 中進行相似性檢索，得到與菌株序列最相近的菌株，有6 種菌的同源性達到99%。綜合形態觀察、生理生化試驗和16S rDNA 的序列測定結果，鑒定菌株FH2 為蠟狀芽孢桿菌（ Bacillus cereus） 。
2。 3 反硝化脫氮工藝的運行效果
為普通反硝化脫氮工藝和生物強化反硝化脫氮工藝的運行效果對比。由圖3 （ a） 可見，在NO —3 — N 濃度為40 mg /L 的條件下啟動普通反硝化脫氮反應器，由于活性污泥本身有一定的脫氮能力，第1 天對NO —3 — N 就有少量的去除，在前6 d 出水NO —3 — N 濃度呈逐漸減少的趨勢，并且NO —2 — N 沒有形成大量積累，說明活性污泥對進水NO —3 — N 已逐步適應； 第7 天開始出水NO —3 — N 濃度明顯減少，此時NO —2 — N 濃度較前一天升高，這可能是因為微生物對NO —3 — N 的降解較快，但還未及時將生成的NO —2 — N 轉化，第7 天脫氮率達到76。 65%，反為了穩定微生物的反硝化效果，普通脫氮反應器在進水NO —3 — N 為40 mg /L 的條件下繼續運行了3 d，反硝化效果進一步提升，接近100%。在后續提高進水NO —3 — N 負荷的過程中，每次在提高進水負荷當天的出水濃度均波動較大，表明每次提高負荷均對微生物有一定沖擊，且微生物的數量可能還暫時不能滿足更高負荷的要求。在進水NO —3 — N濃度為60 ～ 160 mg /L 時，系統對進水負荷提高的適應速度較快，基本上從第3 天開始出水水質就開始好轉，第4 ～ 5 天脫氮率達90% 以上，出水NO —3 — N濃度較低； 在進水NO —3 — N 濃度提高到180 ～ 220mg /L 時，對總氮的去除率影響較小，最終脫氮率均可達到90%以上，但由于進水濃度較高，使得出水濃度也較高； 當進水NO —3 — N 濃度提高到240 mg /L時，對微生物出現了較大的抑制作用，從第5 天開始出水水質逐漸好轉，在該負荷下一共運行了10 d，最終脫氮率為95。 53%。為了探究該反應器的進水NO —3 — N 負荷極限，將進水NO —3 — N 提高到260mg /L 后繼續運行了9 d，在此過程中，脫氮率一直在70%左右，出水NO —3 — N > 60 mg /L、NO —2 — N > 1。 5mg /L。因此，為了保證出水效果，普通反硝化脫氮工藝的進水NO —3 — N 濃度不宜超過240 mg /L。生物強化工藝在啟動階段，
第1 天沒有明顯的效果，與普通工藝差別不大，但從第2 天開始便有了較好效果，第4 天處理效果很明顯，脫氮率達到84。 34%，出水NO —3 — N 為5。 45 mg /L、NO —2 — N 為0。 814 mg /L，反應器啟動成功，啟動時間較普通工藝有明顯的縮短。當進水NO —3 — N 在60 ～ 120 mg /L 時，每次20 mg /L 的進水NO —3 — N 提高量對工藝運行影響極小，微生物很快就能適應，達到理想去除率的時間比普通工藝減少1 d 以上，所以在后續提高負荷時每次提高40 mg /L。在生物強化條件下，能達到理想脫氮效果的進水NO —3 — N 濃度最高為340 mg /L，進一步提高到380 mg /L 時出現了與普通工藝相似的情況，即使進一步投加生物強化菌也未得到改善。在兩個反應器中，出水NO —2 — N 濃度一直較低，沒有出現積累，說明系統對NO —3 — N 的去除是建立在將其轉化為氣態產物之上的。對知，生物強化工藝明顯縮短了系統啟動周期，在提高進水負荷時，適應時間短、適應性強，所能承受的最高進水NO —3 — N 濃度比普通工藝提高了100 mg /L，反硝化脫氮能力得到明顯增強，表明采用該菌（ 蠟狀芽孢桿菌） 進行生物強化反硝化脫氮能縮短微生物培養馴化時間，迅速提高生物處理系統中微生物的濃度，提高處理效率。
3 結論
① 從穩定運行的反硝化裝置中優選出代號為FH2 的高效反硝化功能菌株，經鑒定該菌株為蠟狀芽孢桿菌。在靜態試驗中，該菌在NO —3 — N 濃度為400 mg /L 條件下的脫氮率高達100%，并且代謝速率快，基本沒有亞硝酸鹽的積累，表現出了很強的脫氮能力。
② 與普通反硝化系統相比，投加FH2 菌的生物強化系統的啟動時間明顯縮短，在進水負荷提高時，適應時間更短、適應性更強，在達到理想脫氮率時所能承受的最高進水NO —3 — N 濃度為340 mg /L，比普通系統提高了100 mg /L，系統的反硝化脫氮能力得到明顯提高。
③ 分離得到的蠟狀芽孢桿菌本身的反硝化能力很強，且有芽孢的微生物具有很強的抗逆性，在進行生物強化應用過程中可抵抗外界不良環境，適應性強，易存活，所以將該菌作為菌源進行生物強化反硝化脫氮具有很強的應用性。
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