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富勒烯封端的聚谷氨酸芐酯膜的制備及清除自由基能力的測定
引言
富勒烯及其衍生物在化學、生物醫學、材料學及生命科學等領域有許多的重要的應用前景，因而受到許多研究者的青睞。但是由于富勒烯的籠狀結構使其具有其強的親脂性，這就導致了其在水中的溶解度很小，使它在生物體系中的研究應用受到很多限制。當前，眾多研究者都致力于富勒烯聚合物的合成，這樣既可以將富勒烯的良好化學性質體現出來，而富勒烯的引入又使得聚合物具有更好的特性，包括機械性和熱學性等。迄今為止，富勒烯聚合物已經成功應用于電致發光裝置（electroluminescent devices）、生物活性材料（bioactivematerials）、光學限幅器（optical limiter）、氣體分離膜（gas separation membranes）等[1-6]。
目前，有研究者將聚谷氨酸芐酯制備成膜[7]，以研究其生物學效應，但是對于富勒烯多肽類的成膜制備以及生物學效應研究還沒有報道。本章通過鑄膜法將富勒烯封端的聚谷氨酸芐酯制備成膜，并通過鄰苯三酚自氧化實驗研究其生物學效應。鄰苯三酚自氧化實驗主要研究以富勒烯的特征為主的清除自由基能力。
1 實驗部分
1.1 儀器與試劑
TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；恒溫水浴箱：
北京市醫療設備廠富勒烯封端的聚谷氨酸芐酯（FPBLG）、聚谷氨酸芐酯（PBLG）均自制FPBLG: 1H NMR（400 MHz,CDCl3），δ：2.2(m,2H), 2.6(d,2H), 3.706(t,2H), 3.739(t,2H),4.24(t,2H), 7.26(m,5H); FTIR(KBr), υmax/cm-1: 696.93, 1520.13, 1625.38, 3033.64, 3290.51;UV-Vis，λ: 229 nm、258 nm、283 nm、418 nm、468 nm、486 nm、494 nm、547 nm、577 nm；MALDI-TOF MS(基質：CCA)：數均分子量Mn=1788,重均分子量Mw=1802，分子量分布PDI=1.007.
PBLG: 1H NMR(400 MHz,CDCl3), δ：2.2(m,2H),2.6(d,2H),3.9(t,H),7.26(m,5H); FTIR(KBr),υmax/cm-1: 696.81, 1541.17, 1663.76(C=O), 2955.86, 3296.86; UV-Vis，λ: 229 nm、258 nm、468nm、556 nm；MALDI-TOF MS(基質：CCA)：數均分子量Mn=5847,重均分子量Mw=6266，分子量分布PDI=1.07.
焦性沒食子酸（鄰苯三酚）、抗壞血酸（維生素C）、HAc、Tris、EDTA-2Na 均為分析純
1.2 膜制備
本文采用鑄膜法[7]制備膜，分別取0.165g FPBLG 和PBLG 溶于10mL 二氯甲烷中制成16.5%溶液，室溫下溶劑揮發成膜，脫模后60℃真空干燥至恒重。
1.3 水溶脹率的測定
將試樣在(50±2)℃干燥6 h 恒重稱量后，在(25±2)℃ 的恒溫去離子水中浸泡不同時間。用濾紙迅速擦干試樣表面的水后稱量。取 3～5個樣品的平均值。吸水率 W=(m2-m1)/m1×100%，式中，m1 和 m2 分別為膜的干、濕質量。
1.4 膜密度的測定
由ρt = aρx/(mt-m0)計算聚谷氨酸芐酯膜的密度，式中，m0 為容器及去離子水的質量和，mt 為薄膜浸入水中后容器及去離子水的質量之和，a 為試樣質量，ρx 為水的密度(0.9970g/cm3)，ρt 為聚谷氨酸芐酯膜的密度，其中FPBLG 為2.991 g/cm3，PBLG 的膜密度為1.994g/cm3。
1.5 鄰苯三酚自氧化體系檢測超氧陰離子自由基[8]
按照， 取兩支試管按下表加入25℃預熱過的緩沖液，然后加入預熱過的鄰苯三酚（空白管用10mmol/L HAc 代替鄰苯三酚），迅速搖勻，立即傾入1cm 比色杯中，在320nm波長處測定光吸收值，每隔15s 讀數一次，測定4min 內每分鐘光吸收值的變化。可增減鄰苯三酚的加入量，以控制光吸收值。
1.6 數據處理
本文使用 Excel 統計軟件按學生氏t-檢驗方法進行統計學分析。數據表示平均值±標準偏差，直方圖中數據柱代表平均值，上下誤差線代表標準偏差。
2 結果與討論
2.1 水溶脹率的測定
分別測定了 FPBLG 和PBLG 的一周后及兩周后的水溶脹率， 從圖中可知，一周后的水溶脹率基本為7.9%，變化不大；兩周后變化很大，為29.17%，且兩種膜的水溶脹率沒有太大區別。
從中可以看出，膜的水溶脹率隨時間的變化有很大的變化，影響薄膜吸水率的主要因素[9]有薄膜的分子結構（如聚谷氨酸的羥基將會增大薄膜樣品的親水性，提高吸水率）、浸泡時間、溫度、表面條件、壓力等。
2.2 清除自由基能力的測定
檢測了黑暗情況下，不同質量的FPBLG 膜、PBLG 膜以及Vc 對鄰苯三酚自氧化速率的影響所示：
通過畫出每條曲線的趨勢圖，并作出斜率，可以由下列公式計算出各種膜的清除速率。
S=(K0-K1)/K0×100%其中K0 代表鄰苯三酚的標準自氧化速率，K1 代表加藥組的自氧化速率。
據此可測各種膜的清除速率：
S0.025g FPBLG=30.93%；S0.05g FPBLG=72.16%；S0.02g Vc =82.47%從上圖可以看出，FPBLG 膜可以減慢鄰苯三酚自氧化的速率，對自由基有清除作用，且清除作用隨膜量的增加而增加。而PBLG 膜則對自由基基本上沒有清除作用。通過測定Vc 清除自由基的能力，與膜清除自由基的能力做了比較，結果發現0.02g 的Vc 清除自由基的能力與0.05g 的富勒烯封端的聚谷氨酸芐酯的能力相似。
由于要測物質的清除自由基的能力必須將其溶解于水溶液中，已有研究，將富勒烯聚合物制成納米顆粒水懸液[10]，從而可以測定其的清除自由基的能力。而對于膜的制備以及生物學效應的研究目前還沒有過報道，本文首次測定了富勒烯聚合物膜的清除自由基的能力。但是也有不足，由于膜的質量較小，所以如若將其沉在比色皿底部，難度較大，本文將其緊貼在比色皿的非透光一端，從而對測定OD 值不產生影響。
3 結論
本文將自制的富勒烯封端的聚谷氨酸芐酯及聚谷氨酸芐酯分別制備成膜，測定了膜的密度以及水溶脹率，并利用鄰苯三酚自氧化體系檢測了不同質量的膜在黑暗條件下清除自由基的能力，結果發現FPBLG 的清除效果顯著，且隨膜量的增加清除自由基的能力明顯增強。
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