三種方法檢測耐甲氧西林葡萄球菌方法的評價

三種方法檢測耐甲氧西林葡萄球菌方法的評價

三種方法檢測耐甲氧西林葡萄球菌方法的評價

【關(guān)鍵詞】 耐甲氧西林葡萄球菌；MecA基因；頭孢西林紙片擴散法；微量稀釋法

　　［摘要］ 目的：評價3種檢測耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)方法的臨床應(yīng)用價值。方法：用頭孢西丁紙片擴散法，苯唑西林微量稀釋法和PCR檢測mecA基因?qū)εR床分離98株葡萄球菌進行檢測并作比較。結(jié)果：98株中有63株耐甲氧西林葡萄球菌，3種檢測方法差異無顯著性。結(jié)論：頭孢西丁紙片擴散法可作為基層醫(yī)院微生物實驗室日常工作檢測甲氧西林的簡便又準確的實驗方法。

　　［關(guān)鍵詞 耐甲氧西林葡萄球菌；MecA基因；頭孢西林紙片擴散法；微量稀釋法

　　葡萄球菌是人類感染的最重要的病原菌之一［1］，其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin　resistant staphylococcus aureus，MRSA)所造成的院內(nèi)感染一直是臨床普遍關(guān)注的問題，而凝固酶陰性的耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin resistant oaagulase megative staphylooocci，MRCNS)近年來報道增多，其耐藥性比凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌更高，造成臨床治療上的困難。由耐甲氧西林葡萄球菌(methicillin resistant staphylooocci，MRS)引起的感染已經(jīng)成為臨床抗感染治療的難題之一。怎樣快速、準確地檢測出MRS及預(yù)測其耐藥性變化對臨床治療及合理應(yīng)用抗生素都有十分重要的意義。為此，我們對MRS的檢測方法進行了探討，現(xiàn)報告如下。

　　1　材料與方法

　　1．1　材料

　　1．1.1　菌株來源　收集了2005年9月至12月本院臨床科室各類標本中分離的葡萄球菌共98株，并經(jīng)血漿凝固酶試驗和法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的VITEK32全自動微生物分析儀系統(tǒng)，配套的GPI和GNI細菌鑒定板鑒定，嚴格按照細菌鑒定程序進行。金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC 25923。

　　1．1.2　主要試劑　GPI細菌鑒定板和GPS藥敏板條為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。頭孢西丁(30 μg)紙片為英國OXOID公司商品，藥敏試驗所用培養(yǎng)基MuelleHinton(MH)瓊脂購自杭州微生物試劑廠。mecA基因檢測引物由上海生物工程公司合成。

　　2　方法

　　2．1　最低抑菌濃度(MIC)測定　用GPS-109藥敏鑒定卡在Vitek32全自動微生物分析/藥敏系統(tǒng)測定苯唑西林MIC，遵循美國臨床和實驗室標準化研究所CLSI制定的判斷標準。

　　2.2　頭孢西丁紙片擴散試驗　按CLSI推薦的Kirby-Bauer法進行，菌液濃度0.5麥氏濁度(1.5×108 CFU／ml)。結(jié)果判斷標準：金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑≤19 mm為耐藥，≥20 mm為敏感，凝固酶陰性葡萄球菌抑菌圈直徑≤24 mm為耐藥，≥25 mm為敏感。

　　2．3　PCR檢測mecA基因　挑取菌落置入內(nèi)含有100 μl生理鹽水的0.5 mL離心管內(nèi)，離心(15 000 r／min)5 min吸棄上清液加裂解液A(0.5%非離子去污劑)50 μl和裂解液B(200 ug／ml蛋白酶K)5 μl置55 ℃保溫1 h后置入95 ℃保溫5 min。離心(10 000 r／min)30 s，上清液即為模板。PCR引物序列P1(5’-GCAATCGCTAAAGAACTAAG-3’)，P2(5’-AATGGGACCAACATAACCTA-3’)，PCR反應(yīng)體系50 μl，熱循環(huán)參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃1 min，48 ℃1 min，72 ℃1 min，循環(huán)30次，72 ℃延伸10 min，PCR擴增產(chǎn)物作2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠電泳成像儀下觀察，以224 bp處出現(xiàn)熒光條帶為mecA基因陽性。金葡菌ATCC 25923作為陰性對照，陽性對照模板DNA由上海生物工程公司提供。

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