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銀杏萜類內酯含量測定使用外標四點法可靠性的探討
作者:黃喆雯，唐欽強，王存芳
【摘要】 目的 探討外標四點法的可行性。方法 HPLC法，色譜柱：ALLTECH C18(4.6mm×250mm，5μm)，流動相：正丙醇-四氫呋喃-水(1：15：85)，流速1.0ml/min，ELSD參數：漂移管溫度108.0℃；載氣(壓縮空氣)流速3.10L/min。結果 外標四點法得出回歸方程，經統計學方法證明成立，且相關系數r顯著。結論 外標四點法可以用于銀杏萜類內酯的含量測定。
【關鍵詞】 銀杏葉萜類內酯；含量測定；HPLC-ELSD；外標四點法
Study on reliability of ESM of four points to determine the assay for Ginkgo Terpene Lactones
【Abstract】 Objective Study on the reliability of ESM of four points.Methods HPLC system consisting of an Alltech C18 column(4.6mm×250mm，5μm)，and the mobile phase was n-Propyl alchol，tetrahydrofuran and water (1:15:84) at flow rate of 1.0ml/min.The detector temperature was 108.0℃ and the dry gas flow rate was 3.10L/min.Results The ESM of four points has been established.Conclusion The ESM of four points can be used on determine the assay for Ginkgo Terpene Lactones.
【Key words】 ginkgo terpene lactones；assay；HPLC-ELSD；ESM of four points
有關銀杏葉中萜類內酯的含量測定方法的報道較多，目前銀杏葉制劑的萜類內酯含量測定方法采用的多為HPLC法［1～3］。我們亦采用2005版中國藥典收錄的HPLC法［4］，蒸發光散射檢測器進行測定。HPLC-ELSD使用外標兩點法對數方程分別計算白果內酯、銀杏葉內酯A、銀杏葉內酯B和銀杏葉內酯C的含量，四種銀杏內酯的含量之和為萜類內酯含量。我們在實際工作中使用外標兩點法時，直接從數值上難以判斷對照溶液的配制是否準確，及其外標兩點法對應的工作曲線(n＝2)是否可靠。因此，同時配制兩份對照溶液各自分別測定5μl、10μl兩點，將四個濃度和相應峰面積一條標準曲線（n＝4），得出回歸方程及相關系數r，通過統計學方法考察曲線和回歸方程是否成立［5］。
1 儀器與試藥
1.1 儀器 高效液相色譜儀：SHIMADZU-10A；蒸發光散射檢測器ALLTECH ELSD2000。
1.2 試藥 白果內酯，銀杏葉內酯B、銀杏葉內酯C對照品購于中國藥品生物制品檢定所；銀杏葉內酯A對照品購于SIGMA。甲醇為色譜純；水為自制超純水；其他試劑均為分析純。
2 方法與結果
2.1 色譜條件與系統適應性試驗 色譜柱：ALLTECH C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：正丙醇-四氫呋喃-水(1：15：84)；流速1.0ml/min；ELSD參數：漂移管溫度108.0℃；載氣(壓縮空氣)流速3.10L/min；柱溫35℃；進樣量5、15μl。理論塔板數按白果內酯峰計算應不低于2500，相鄰峰的分離度應＞1.5。
2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取經五氧化二磷干燥過夜的白果內酯、銀杏葉內酯A、銀杏葉內酯B和銀杏葉內酯C對照品適量，置同一10ml量瓶中加甲醇稀釋至刻度，混勻，即得。
2.2.1 對照品溶液一 白果內酯22.73mg、銀杏內酯A 13.42mg、銀杏內酯B 11.13mg和銀杏內酯C 9.05mg。
2.2.2 對照品溶液二 白果內酯14.71mg、銀杏內酯A 11.34mg、銀杏內酯B 12.24mg和銀杏內酯C 18.99mg。
以對照品濃度的自然對數InC(x)為橫坐標，峰面積的自然對數InA(y)為縱坐標作圖，見圖2～5。
圖中四點有成一條直線的趨勢，在直線方程y＝ax b中，通過統計計算按公式1、2、3分別求出兩個常數a，b及直線的相關系數r，見表2。
2.3 外標四點法直線回歸方程的確定 分別精密吸取對照品溶液一和二5μl、15μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖。結果：對照溶液中白果內酯(tR＝8.375)、銀杏葉內酯A(tR＝9.811)、銀杏葉內酯B(tR=12.040)和銀杏葉內酯C(tR＝7.194)，相鄰組分分離效果良好(見圖1)。濃度與峰面積的數據及處理見表1。
圖1 萜類內酯對照溶液HPLC圖
(出峰順序為銀杏內酯C，白果內酯，銀杏內酯A，銀杏內酯B)
表1 對照進樣量(μg)與峰面積
圖2~5
1
2.4 直線回歸方程的統計學檢驗
2.4.1 相關系數檢驗法 相關系數表示兩變量間關系的密切程度。使用相關系數檢驗法來進行相關系數的顯著性測驗。見表2。
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