醫學檢驗專業的畢業論文

時間：2024-10-15 18:05:04 醫學畢業論文我要投稿

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醫學檢驗專業的畢業論文

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醫學檢驗專業的畢業論文

　　摘要：基于石墨烯量子點( GQDs) 的熒光性能建立了一種非標記熒光方法，用于靈敏和選擇性測定抗壞血酸( AA) .GQDs 溶液在紫外光激發下發出很強的藍色熒光，當向溶液中加入 AA 后，GQDs 溶液的熒光被猝滅。猝滅機理可能為在弱酸性介質中，AA 與 GQDs 發生氧化還原反應，AA 轉移電子給 GQDs.熒光猝滅強度與AA 濃度在 5.0 × 10- 6~ 7.5 × 10- 5mol / L 范圍內呈良好的線性關系，檢出限低至 1.0 × 10- 6mol / L.該體系成本低、操作簡單，并且在多種可能干擾的物質存在下對 AA 表現出很高的選擇性。本方法應用于生物樣品中AA 的檢測，回收率在 95.2% ~ 115.3% 之間。

　　關鍵詞： 石墨烯量子點; 熒光探針; 非標記方法; 抗壞血酸。

　　Abstract: A label-free fluorescence method based on the fluorescence property of graphene quantumdots ( GQDs) was developed for sensitive and selective detection of ascorbic acid ( AA) .The initialstrong blue fluorescence of the GQDs in aqueous solution was effectively quenched upon addition ofAA.The quenching mechanism may involve transfer of electrons from AA to GQDs via the redox re-action of AA and GQDs in weak acid solution.The quenching efficiency was linearly proportional tothe concentration of AA within the range of 5.0 × 10- 6- 7.5 × 10- 5mol / L with a low detection limitdown to 1.0 × 10- 6mol / L.The proposed sensing system is simple and low-cost with facile experi-mental operations,and has a high selectivity for AA over a number of possible interfering species.Additionally,this method was successfully applied to the determination of AA in biological sampleswith satisfactory recoveries ( 95.2% - 115.3% ) .

　　Key words: graphene quantum dots; fluorescence probe; label-free method ; ascorbic acid.

　　1、引言。

　　石墨烯量子點( GQDs) 是最近發現的粒徑小于 100 nm 具有0 維結構的石墨烯納米片[1-3].與石墨烯類似，GQDs 也有大的表面積和 π-π 共軛網狀結構。作為一種新的碳納米熒光材料，GQDs由于其優越的光穩定性、優良的光學和電化學性能、高的熒光活性、抗光漂白能力和低細胞毒性[4-8],已經在化學、材料、物理學和生物學領域引起較大關注并成為當前的研究熱點之一，目前已用于氯離子[9]、磷酸[10]、三磷酸腺苷[11]、三價鐵離子[12]、過氧化氫[13]、葡萄糖[14-15]、免疫球蛋白 G[16]、生物巰基化合物[17-18]、脫氧核糖核酸[19]和胰蛋白酶[120]的檢測，以及用于藥物釋放[21]和生物成像[22-24]等領域。

　　抗壞血酸( AA) 是一種重要的抗氧化劑，在人體平衡氧化壓力中起重要作用。AA 在人體液中存在的濃度相對較高，例如，人血液中 AA 的濃度為 6 ~ 15 μg/mL[25].AA 是治療壞血病、藥物中毒、肝臟疾病、過敏反應和動脈粥樣硬化的藥物，并能幫助促進健康細胞的發展、鈣的吸收和正常組織的生長。在制造果汁和飲料時，AA 也作為一種抗氧化劑使用。因此，AA 的檢測對制藥、臨床和食品工業均具有重要意義[26].目前檢測AA 的方法主要有電化學方法[27]、化學發光法[28]、高效液相色譜法[29]、分光光度法[30]、毛細管電泳法[31]和熒光分析法[32]等。電化學方法由于靈敏度高，是檢測 AA 的主要方法。但是，與AA 具有相似還原性質的分子如尿酸( UA) 和多巴胺( DA) 對該方法造成的干擾較大，而且 AA 的氧化產物會吸附在電極表面，影響體系的穩定性和重現性。熒光分析法具有簡單、方便和快速等優點。因此，本工作以 GQDs 作為熒光探針，建立了基于 GQDs 的熒光猝滅檢測 AA 的新方法。

　　2、實驗。

　　2.1 儀器與試劑。

　　LS-55 型發光光度計( Perkin-Elmer,USA) ; Cary60 型紫外可見分光光度計( Agilent Technologies,USA) ; PHSJ-4A 型 pH 計( 上海精密科學儀器有限公司) ; XW-80A 型漩渦振蕩混合器( 上海醫科大學儀器廠) ; TGL-16G-A 型高速冷凍離心機( 上海安亭科學儀器廠) 等; SZCL-3B 數顯智能控溫磁力攪拌器( 鞏義市予華儀器有限責任公司) ;78-1 磁力加熱攪拌器( 常州國華電器有限公司) ; BS 110S 電子天平( 北京賽多利斯天平有限公司) ; FL3-P-TCSPC 時間分辨熒光儀( HORIBA JOBIN JVON,France) ; JEM-2100F 場發射透射電子顯微鏡( JEOL) ; Multimode 8原子力顯微鏡( Bruker,USA) .

　　抗壞血酸( AA) 、人血清白蛋白( HSA) 購于美國 Sigma-Aldrich 公司; 多巴胺( DA) 購于 AlfaAesar 公司; D-色氨酸 ( D-Trp) 、DL-蘇氨酸 ( DL-Thr) 、L-α-丙氨酸 ( L-α-Ala) 、L-組氨酸 ( L-His) 、D-絲氨酸 ( D-Ser) 、L-賴氨酸 ( L-Lys) 、L-亮氨酸( L-Leu) 、L-苯丙氨酸( L-Phe) 由中國醫藥( 集團)上海化學試劑公司提供; 尿酸( UA) 購于上海生工生物有限公司; 半乳糖( Gal) 、果糖( Fru) 、甘露糖( Man) 購于比利時 Acros Organics 公司; 檸檬酸購于廣州化學試劑廠。

　　實驗所用其他化學試劑均為國產分析純，實驗用水為 18.2 MΩ·cm 的超純水。

　　實驗所用的緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液( 1.0 ×10- 2mol / L,pH 4.0 ~ 7.5) : 稱取 0.78 g NaH2PO4·2H2O,溶于 450 mL 超純水中，定容至 500 mL,用H3PO4和 NaOH 溶液調節 pH 值。

　　2.2 人血清樣品的預處理。

　　人血清樣品取自桂林市第五人民醫院。取200 μL 人血清，置于 1.5 mL 離心管中，加入 400μL 乙腈，漩渦震蕩混合 5 min,在高速冷凍離心機上以 1.2 ×104r / min 的速度離心 20 min,取上層清液，用氮氣吹干，殘留物用 1 000 μL 超純水溶解，試液置于冰箱中 4 ℃保存備用。

　　2.3 GQDs 的合成。

　　GQDs 的合成方法參照文獻[33].稱取 2.0g 檸檬酸加入試管中，加熱至 200 ℃ ,當檸檬酸全部融化后開始計時。20 min 后，溶液顏色變為橘紅色。在磁力攪拌作用下，將橘紅色液體用滴管逐滴加入 100 mL 含 10 mg NaOH 的溶液中，用HCl 調節 pH 至 7.0,得到 GQDs 水溶液，濃度為14 mg / mL,于 4 ℃ 下避光保存。

　　2.4 實驗方法。

　　在一系列0.6 mL 的離心管中，依次加入10 μL1.4 mg / mL GQDs、10 μL 不同濃度的 AA 以及 80 μLpH =4.5 的磷酸鹽緩沖液，充分混勻后，在 37 ℃ 下孵育4 h.冷卻后，采用 LS-55 型發光光度計( Per-kin-Elmer,USA) 記錄樣品在 453 nm 處的熒光強度，設置電壓為750 V,激發、發射狹縫寬度均為15 nm,掃描速度為1 000 nm/min,激發波長為367 nm.

　　3、結果與討論。

　　3.1 GQDs 的表征。

　　所合成的 GQDs 的透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡圖像、紅外光譜、紫外吸收光譜和熒光光譜均參見文獻[34].本實驗合成的 GQDs 的粒徑為17 ~21nm,平均厚度為 1.5 nm.GQDs 表面存在羧基和羥基，這些官能團賦予了 GQDs 優良的水溶性。GQDs在紫外區有較強的吸收，在 360 nm 處有一吸收峰，并且在 365 nm 紫外燈照射下可觀察到藍色熒光。GQDs 具有對稱的激發和發射光譜，其最大激發波長為367 nm,最大發射峰波長為453 nm.

　　3.2 熒光猝滅機理。

　　GQDs 的熒光猝滅機理。GQDs本身在激發光照射下發出藍色熒光。已有研究證明，氧化石墨烯( Graphene oxide,GO) 能被 AA 還原[35].因為本實驗合成的 GQDs 表面帶有-COOH,與 GO 具有相似的表面基團，因此加入 AA后，AA 與 GQDs 發生氧化還原反應，AA 被氧化為脫氫抗壞血酸 ( dehydro-AA) 并轉移電子給GQDs,GQDs 的熒光被猝滅。

　　3.2.1 紫外吸收光譜。

　　猝滅機理也可通過紫外光譜來證明。加入 AA 后，GQDs 在 360 nm 處的特征峰消失，說明 GQDs 與 AA 反應生成了其他物質。

　　3.2.2 熒光壽命。

　　為了進一步證實 AA 對 GQDs 的猝滅機理，實驗測定了體系的熒光壽命是 AA 加入前后 GQDs 的熒光衰減曲線。

　　表 1 是 GQDs 猝滅前后的熒光壽命值。從表中可以看到，AA 加入前后，體系的熒光壽命發生了明顯變化，說明猝滅過程是動態猝滅[36-37].動態猝滅是碰撞過程，因此 AA 猝滅 GQDs 的熒光機理可解釋如下：

　　GQDs + h ν →* GQDs + AA→[* GQDs…AA]( 碰撞復合物 )→GQDs-+ AA+( 還原態的電子轉移)[38]

　　激發態分子* GQDs 遇到AA,兩者相互作用導致電子和能量的轉移，最終導致* GQDs 的熒光猝滅。

　　3.3 可行性驗證。

　　為了考察本方案的可行性，我們對 GQDs 與AA 反應前后的樣品溶液進行了熒光光譜掃描。AA 加入后，GQDs 在 453 nm 的熒光強度降低，熒光被猝滅了 79.6%,說明該方法能用于 AA 的檢測。

　　3.4 AA 與 GQDs 作用時間的優化。

　　實驗考察了 AA 加入后，GQDs 溶液的熒光強度隨時間的變化。見，體系的熒光強度隨時間的延長而逐漸下降，在大約4h 以后，熒光強度降低速度減慢，之后熒光強度變化不大。為了保證測定的靈敏度同時縮短分析時間，實驗選擇4 h 作為 AA 與 GQDs 的作用時間。

　　3.5 pH 值的優化。

　　實驗以磷酸鹽為緩沖液，考察其 pH 值對 AA猝滅 GQDs 熒光的影響，結果。GQDs本身的熒光會受 pH 的影響。當 pH 在 4.0 ~7.5之間時，GQDs 的熒光隨 pH 的升高而增強，但體系在 pH =4.5 時有最高的信噪比。因此，實驗選擇 pH =4.5 的磷酸鹽緩沖液作為 AA 與 GQDs 的反應緩沖液。

　　3.6 線性范圍和檢出限。

　　在上述優化的條件下，實驗對一系列不同濃度的 AA 進行了檢測，實驗結果。可以看出，隨著 AA 濃度的增大，體系在 453nm 處的熒光強度逐漸降低，并且熒光強度值的比值 F0/ F( F0為 GQDs 的熒光強度，F 為加入 AA之后體系的熒光強度) 與 AA 的濃度在5.0 ×10- 6~7.5 × 10- 5mol / L 范圍內呈現良好的線性關系，其線性方程為 F0/ F = 0.0537C + 0.7467,R =0.997 1( C 為 AA 的濃度，單位 10- 6mol / L) ,檢測限( 3σ，σ = S0/ S,S0為空白溶液多次測量的標準偏差，S 為標準曲線的斜率) 為 1.0 ×10- 6mol / L.我們將本方法與其他檢測 AA 的方法做了對比，見表 2.從表 2 中可以看出，該方法與其他方法相比具有較高的靈敏度。

　　為了考察該方法的精密度，實驗將 7.5 ×10- 5mol / L AA 與 GQDs 反應進行了 11 次平行測定，得到熒光強度的相對標準偏差 ( RSD) 為3.4% .3.7 特異性考察。

　　為了考察所建立方法的特異性，實驗選用幾種糖類以及 HSA、尿素( Urea) 和幾種氨基酸作為對照樣品進行分析。GQDs 的濃度為 0.14 mg/mL,AA 的濃度為 7.5 × 10- 5mol / L,其他作為干擾物質的濃度均為 7.5 × 10- 5mol / L.實驗結果。可以看出，只有 AA 的加入能引起信號的明顯變化，其他物質均不存在干擾，特別是 DA、UA 這兩種與 AA 有相似電化學性質的物質，也不存在干擾。因為在本實驗中，AA 與GQDs 的反應介質為 pH = 4.5 的磷酸鹽緩沖液，在這個 pH 值下，DA、UA 均不干擾 AA 的測定。

　　3.8 實際樣品分析。

　　為了考察本研究所建立的方法是否可用于實際樣品的檢測，實驗對人血清樣品進行了分析。從醫院取的血清樣品按照 2.2 節方法進行處理，在稀釋 50 倍后的血清中進行加標實驗，實驗結果如表 3 所示。從表中可以看到，人血清中 AA 的加標回收率在 95.2% ~115.3%范圍內。

　　4、結論。

　　建立了一種基于 GQDs 熒光猝滅檢測 AA的新方法，該方法操作簡便，靈敏度高，檢出限低至 1.0 ×10- 6mol / L,特異性強，一些糖類和氨基酸的存在均不干擾 AA 的測定，甚至是與 AA有相似電化學性質的 DA、UA 的存在對 AA 的檢測也沒有影響。本實驗用到的所有原料都價廉易得且不需要任何修飾過程，GQDs 相對于其他量子點的合成更簡單而且具有低毒性，有望應用于生物體內生物活性物質的檢測。

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