低氧條件下大鼠視網膜葡萄糖調節蛋白的表達
【摘要】 目的 研究低氧條件下葡萄糖調節蛋白(grp78)在大鼠視網膜中的表達情況,探討內質網應激在視網膜低氧條件下的作用及其機制。方法 Wistar大鼠30只,隨機分為正常對照組和實驗組,正常對照組飼養于常氧環境中,實驗組飼養于低氧倉。實驗組又按照在低氧倉飼養時間分為6、12、24、48和72 h等5個亞組,并于這5個時間點處死大鼠,摘除眼球,應用免疫組織化學方法和RT?PCR法測定各組大鼠grp78蛋白表達。結果 grp78在正常大鼠視網膜中少量表達,低氧條件下6 h開始升高,24 h到達高峰,72 h降至正常水平。低氧條件下6、12、24、48 h表達量與正常對照組比較差異有顯著性(F=32.22,q=5.32～11.53,P＜0.05);72 h 視網膜grp78的表達與正常對照組相比,差異無顯著性(q=2.79,P >0.05)。結論 低氧條件下grp78在大鼠視網膜中表達,它參與了大鼠視網膜低氧損傷的發生機制。
【關鍵詞】 葡萄糖調節蛋白;視網膜;缺氧;大鼠,Wistar
�。跘BSTRACT］ Objective To investigate the expression of glucose regulated protein (grp78) under hypoxia and to study the effect and mechanism of endoplasmic reticulum stress. Methods Thirty wistar rats were randomly divided into normal control group and experimental group. The rats in the experimental group were killed after hypoxia breeding for 6, 12, 24, 48 and72 hours, respectively; the eyeballs were then removed. The expression of grp78 was studied immunohistochemically and by using reverse transcriptase PCR (RT?PCR). Results Expression of grp78 was weak in normal retina, but increased after 6 hours of hypoxia, reached its peak after 24 hours of hypoxia and fell back to the normal level after 72 hours. The differences in expressions of grp78 in the rats after hypoxia breeding for 6, 12, 24 and 48 hours were significant, compared with that of control group (F=32.22;q=5.32-11.53;P<0.05). The difference between breeding of 72 h group and the control group was not significant (q=2.79,P>0.05). Conclusion grp78 is strongly expressed in rat retina under hypoxia and involves in the mechanism of retinal hypoxic injury.
［KEY WORDS］ glucose regulated protein; retinal; anoxia; rats, Wistar
低氧使細胞的生理功能發生改變， 造成全身組織和器官失灌而損傷。內質網應激是指在缺血、低氧或氧化應激等各種因素使細胞內質網生理功能紊亂時,細胞啟動的自我保護反應機制,它有利于細胞內環境穩態的恢復和維持細胞存活[1]。近年來對于內質網應激與全身多種疾病發生發展的關系研究較多。視網膜結構復雜而且代謝旺盛,對低氧等刺激敏感,本實驗觀察大鼠視網膜低氧不同時間內質網應激標志物——葡萄糖調節蛋白(grp78)在視網膜組織中的表達變化，探討內質網應激在大鼠低氧條件下的作用。
1 材料和方法
1.1 實驗材料
成年Wistar 大鼠30 只，雌雄不限,體質量為220～250 g，由青島大學醫學院實驗動物中心提供， 室溫飼養。兔抗鼠grp78 多克隆抗體(美國Stressgen公司),免疫組織化學Biotin SP2HRP Kit(北京中杉公司),Trizol(Invitrogen公司),M2MLV 逆轉錄酶、rTaq 酶(Takara 公司), 引物設計合成由大連寶生物公司完成。
1.2 低氧模型的建立及實驗分組
用有機玻璃（厚度4 cm）制成低氧倉，體積為100 cm×60 cm×60 cm，三氯甲烷封側面，倉體上面開一直徑1 cm的出氣孔，側面開一直徑1 cm的進氣孔，通過三通管分別接氮氣和壓縮空氣。用玻璃轉子流量計（沈陽市北量流量儀器廠）控制流量。Wistar大鼠30只，隨機分為正常對照組（n=5）和實驗組（n=25），正常對照組飼養于常氧環境中，實驗組飼養于氧體積分數為0.05的低氧倉。實驗組又按照在低氧倉飼養時間分為6、12、24、48和72 h等5個亞組，并于這5個時間點處死大鼠(每次5只)，摘除眼球。常規方法制備組織石蠟標本。分別用免疫組織化學染色方法和RT?PCR法測定grp78的表達。
1.3 免疫組織化學染色
石蠟切片常規脫蠟復水，按照免疫組織化學試劑盒說明行SP法染色,陰性對照采用PBS代替一抗。顯微鏡下觀察視網膜組織中grp78的表達情況,染色陽性反應物質表現為棕黃色顆粒,每組標本取5張切片,每張切片取5個視野,數碼照相機采集圖像,用Image?pro?plus 6.0圖像分析軟件測定細胞平均吸光度(A)值。
1.4 逆轉錄多聚酶鏈式反應(RT?PCR)
1.4.1 總RNA提取
大鼠處死后立即摘除眼球,沿角鞏膜緣撕除角膜,小心撥除晶狀體和玻璃體,完整分離視網膜組織,研磨后加入1 mL的trizol,提取總RNA,紫外線分光光度計測定RNA含量。
1.4.2 RT反應
按照試劑盒說明書進行。
1.4.3 PCR反應
grp78引物序列為:上游5′?AGCCCACCGTAACAAT2CAAG?3′,下游5′?TCCAGCCATTCGATCTTTTC?3′,預計擴增片段長度445 bp,β?actin用作內參照(片段長度265 bp)，引物合成參照文獻[2]方法。反應條件:95 ℃預變性3 min; 95 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸60 s,共30個循環;最后72 ℃再延伸10 min。取5 μL PCR產物,以12 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離目的基因片段,溴化乙錠染色,紫外線燈下觀察并攝片,經圖像分析系統測定A值,應用半定量法進行grp78 mRNA定量測定,以基因產物A值和內參照A值比表示。
1.5 統計學處理
采用 SPSS 11.5和PPMS 1.5[3]統計分析軟件進行數據處理,結果以±s表示,數據間比較采用單因素方差分析及SNK?q檢驗。
2 結 果
2.1 各組視網膜中grp78表達的比較
對照組大鼠視網膜組織grp78弱陽性表達,主要分布于視網膜節細胞層和內核層。低氧條件 6 h grp78的表達開始升高,仍表達在視網膜節細胞層和內核層，與對照組相比差異有顯著性(q=5.32,P<0.05);12 h即可見grp78表達明顯增多(q=9.37,P<0.01);grp78的表達高峰出現在24 h(q=15.14,P<0.01);48 h grp78表達開始下降,但仍高于正常對照組(q=11.53,P<0.01)；72 h組grp78的表達與正常對照組相比，差異無統計學意義(q=2.80,P>0.05)。 見表1。
2.2 RT?PCR檢測
grp78 mRNA與內參照GAPDH mRNA的擴增產物片段長度分別為445、265 bp，與預期相符。內參照基因擴增產物均明顯可見，各組視網膜組織grp78 mRNA的RT?PCR產物電泳結果見圖1。半定量分析的結果顯示,對照組大鼠視網膜組織中grp78 mRNA有少量表達。低氧12 h即可見grp78 mRNA表達明顯增多（F=183.61，q=7.83,P<0.01）；grp78 mRNA的表達高峰出現在24 h(q=32.33,P<0.01）；48 h grp78 mRNA表達開始下降，但仍高于對照組(q=23.48,P<0.01）；72 h grp78 mRNA的表達與正常對照組相比，差異無統計學意義(q=0.34,P>0.05）。見表1。表1 各組視網膜中grp78及grp78 mRNA表達的比較（略）
3 討 論
視網膜是高度分化的神經組織，中樞神經系統對低氧最敏感，在人體的感官系統中，視網膜的代謝非常旺盛，主要由有氧代謝提供能量，對低氧的耐受性最低，機體內血氧的濃度及其彌散入組織的水平對維持視網膜組織的正常生理功能起著重要的作用。大量的研究表明，低氧對視網膜的神經元損傷，尤其是神經節細胞的損傷明顯[4]。早在1988年,DAVID發現處于低氧環境中的雞胚胎視網膜內核層、內網狀層及神經節細胞層受損。低氧24 h可導致視網膜所有類型的細胞數明顯下降[5]。
一些眼底疾病如糖尿病性視網膜病變、視網膜中央靜脈阻塞(缺血型)、視網膜中央動脈阻塞等, 可導致視網膜組織低氧[8]。在理論上，內質網應激反應參與了視網膜低氧性病變的發病機制。本實驗構建視網膜低氧模型，觀察大鼠低氧條件下不同時間段grp78的表達變化。結果顯示,在正常視網膜組織中grp78少量表達,主要分布在 RGC層和內核層,低氧條件下6 h grp78 mRNA和蛋白表達均升高,24 h表達升高達到高峰,48 h后表達有所下降。表明低氧條件生存24 h時內質網自穩系統的調節作用達到最佳水平,低氧條件生存后48 h grp78的表達下降可能與低氧細胞的內質網穩態恢復有關,也可能是由于內質網自穩系統遭到了破壞,不能通過增加grp78的表達來結束內質網應激狀態,細胞啟動了凋亡通路。本研究結果提示，grp78的動態表達可能與低氧導致的視網膜損傷的進展密切相關,同時也提示了一種通過誘導內源性grp78生成來延緩低氧導致的視網膜損傷發展的新思路。低氧導致的視網膜損傷的發病機制是多因素、多途徑的結果,若早期在內質網應激環節上加以干預,有可能為延緩低氧導致的視網膜損傷的發展提供新的治療途徑。
【參考文獻】
[1]錢錦. 內質網應激與眼科疾病[J]. 眼科新進展, 2007,27(11):861?864.
[2]吳雅臻,李漫麗,金燕,等. 糖尿病大鼠視網膜中內質網應激蛋白的表達及意義[J]. 眼科研究, 2008,26(4):262?265.
[3]周曉彬,紀新強,徐莉,等. 醫用統計學軟件PPMS 1.5的組成和應用特點[J]. 齊魯醫學雜志, 2009,24(1):29?32.
[4]LUO X, LAMBROU G N, SAHEL J A, et al. Hypoglycemia induced generaneuroal death, whereas hypoxia and glutamate transport blockade lead to selective retinal ganglion cell death in vitro[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2001,42(11):2695?2705.
[5]劉戟環,糜漫天,張乾勇,等. 模擬海拔5 000 m高原間斷性缺氧對大鼠視網膜的損傷及�；撬岬姆雷o作用[J]. 第三軍醫大學學報, 2004,26(21):1936?1939.
[6]MISKOVIC D, SAIYER C L, OHAN N, et al. Isolation and characterization of a encoding axenopus immunoglobulin binding protein [J]. Comp Biochem Physiol Biochem Mol Biol, 2004,116(2):227?234.
[7]ZHAO L H, ACKERMAN S L. Endoplasmic reticulum stress in health and disease[J]. Cur Opi Cell Bio, 2006,18:444?452.
[8]李松濤,周占宇,許光昌,等. β?七葉皂甙鈉對ROP模型大鼠玻璃體內IL?6、IL?8及VEGF表達的影響[J]. 青島大學醫學院學報, 2009,45(3)：289?292.
【低氧條件下大鼠視網膜葡萄糖調節蛋白的表達】相關文章：
大鼠腦干DVC區注射ghrelin對弓狀核NPY mRNA及AgRP mRNA表達的影12-12
清蛋白、前清蛋白和血清超敏C反應蛋白檢測對普外科病人術后感染03-29
大腸桿菌表達人IL?21融合蛋白的純化和抗原性分析03-29
硅油在視網膜脫離復位術后的并發癥及護理01-16
市場條件下的花卉生產管理11-28
次聲作用對大鼠視覺電生理功能的影響12-10
電子商務條件下的網絡營銷03-28
模型輔助條件下抽樣估計方法研究11-23
- 相關推薦