口腔專科畢業論文

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　　1 儀器與材料

　　紫外分光光度儀：日本島津公司；B-220型恒溫水浴鍋：浙江舟山市定海區海源儀器廠；KS-150D型超聲波清洗器：寧波科生儀器廠；SHZ-CD 型循環水式多用真空泵：浙江舟山市定海區海源儀器廠；WFZ-2000型紫外可見分光光度計：尼龍柯儀器有限公司；Shimadzu LC-l0A型高效液相色譜儀：日本島津公司；BS210S 型電子天平（MAX=210g d=0.01mg）：北京塞多利斯天平有限公司；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司；XA-1 型固體粉碎機：金壇市科興儀器廠；SK-1快速混勻器：常州國華電器有限公司。

　　樣品1： 4月下旬采于淮海工學院多年生銀杏樹；樣品2： 4月下旬采于花果山九龍橋百年銀杏樹；樣品3： 4月下旬采于連云港花果山三元宮千年銀杏樹；樣品4：頭年10月下旬采于淮海工學院多年生銀杏樹；樣品5：頭年10月下旬采于連云港花果山九龍橋百年銀杏樹；樣品6：頭年10月下旬采于連云港花果山三元宮千年銀杏樹。6種樣品葉均于55℃恒溫干燥后，粉碎過篩，置于磨口瓶中，密閉避光保存。

　　槲皮素、山萘酚標準品（中國藥品生物制品鑒定所出品）異鼠李素標準品（Biochemika公司），DPPH·（1,1-二苯-2-苦肼基 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl ，Sigma 公司），甲醇。甲醇、鹽酸、磷酸、醋酸等均為分析純試劑，水為去離子水（自制）。

　　2 方法

　　2.2 樣品溶液制備分別稱取6種樣品0.8 g，置于100 ml圓底燒瓶中，加入25 ml甲醇/25%鹽酸（4∶1）混合液，閉塞稱重，置于水浴中沸騰回流1 h，取出后冷卻至室溫，稱重，以甲醇補足減失重量，過濾后轉移至50 ml容量瓶，作為樣品溶液1～6號。

　　2.3 標準溶液最大吸收波長測定分別將槲皮素、山萘酚和異鼠李素標準品及樣品溶液用紫外分光光度儀在200～800 nm進行掃描，獲得最大吸收波長并加以選擇，以防止其他成分干擾。

　　2.4 最佳色譜條件測定通過對流動相中水和甲醇比值、流速及緩沖溶液的選擇等多個方面的改變，獲得將槲皮素、山萘酚和異鼠李素分離的最佳條件。

　　2.5 標準曲線的制作取標準品溶液，在最佳色譜條件下，分別進樣2.5，5，10，15，20，30 μl，以峰面積（mV/min）為縱坐標Y，以進樣量（μg）為橫坐標X，分別作槲皮素、山萘酚和異鼠李素線性回歸曲線。

　　2.6 樣品中槲皮素、山萘酚和異鼠李素含量測定和計算取“2.2”制備的樣品液（1～6號）1 ml分別稀釋于10 ml容量瓶中，在最佳色譜條件下，各進樣15 μl，測樣品中槲皮素、異鼠李素、山萘酚的峰面積A1，A2，A3，由3者的標準曲線及回歸方程，采用外標法，獲得進樣黃酮量，按下式算出槲皮素、山萘酚和異鼠李素的含量。

　　C=（X/15×250）/m樣品

　　式中：C-樣品中黃酮的含量（mg/g）

　　X-進樣溶液中黃酮的量（μg）

　　m樣品-樣品的質量（g）

　　2.7 總黃酮苷含量計算銀杏葉中含有30多種黃酮類化合物，主要以糖苷形式存在，直接測定銀杏黃酮苷的含量較困難，因為種類太多分離困難、對照品不易得。而這些苷中的苷元主要是槲皮素、山萘酚和異鼠李素，通過其苷元的含量再換算成總黃酮苷含量。槲皮素（quercetin）的分子量是302.2，山萘酚（kaempferol）和異鼠李素（isorhamnetin）的分子量分別是286.24和316.27。據報道，槲皮素鼠李糖-對羥基桂皮酰葡萄糖苷（分子量為756.7）是銀杏對心血管系統的主要有效成分，所以被應用作為有效成分含量測定時計算的依據，即黃酮苷與苷元分子量比值取r=756.7/302.2=2.51。總黃酮苷含量=（Q+K+I）×2.51

　　Q、K、I分別表示槲皮素、山萘酚和異鼠李素的黃酮含量。

　　2.8 重復性實驗分別精密稱取樣品3粉末3份，在相同的條件下提取溶液，在選定的色譜條件下測定峰面積。

　　重復性越好說明實驗的精密度越好，重復性一般用相對標準偏差（RSD）表示。將被測樣品進樣3次，根據得到峰面積計算相對標準偏差。

　　2.9 精密度實驗精密吸取樣品3稀釋液15 μl，在最佳色譜條件下，連續進樣3次，測得峰面積，計算其標準偏差和RSD值。

　　2.10 加樣回收率實驗分別準確移取已知含量的樣品1～3號1 ml于3個10 ml容量瓶中，各加入槲皮素標準溶液（288 μg/ml）0.1 ml，混合均勻，按黃酮類化合物的分析方法進行檢測，計算槲皮素的回收率。

　　3 結果

　　本實驗應用高效液相色譜法測定了連云港地區不同年代春秋兩季的銀杏葉黃酮組分，包括槲皮素、山萘酚和異鼠李素的含量。測得的數據表明，6種樣品中春季采摘的銀杏葉中黃酮含量明顯高于秋季銀杏葉。不同樹齡銀杏葉3種黃酮苷元的含量比例順序發生變化：數十年銀杏葉樣品中以槲皮素含量居多，百年樣中山萘酚較多，千年樣中異鼠李素含量明顯高于前兩者。抗氧化活性測定結果與其黃酮含量測定結果基本一致，春季銀杏葉明顯高于秋季銀杏葉。

　　由表2可知，槲皮素含量在樣品1中最高，為0.459%；其次是樣品4，為0.362%，這兩個樣品采于淮工數十年生銀杏。千年生銀杏葉與百年生銀杏葉的含量相差不大；山萘酚含量在樣品2中最高，為0.191%，其次是樣品3，為0.134%，說明秋季樣品山萘酚含量隨樹齡呈遞減趨勢；異鼠李素含量在樣品3中最高，為0.240，其次是樣品6，為0.194%。這兩個樣品均采于千年生銀杏，說明異鼠李素含量隨樹齡呈遞增趨勢，春季樣品各黃酮含量均明顯高于同種秋季樣品。

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